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生物系統去汙劑小百科
2019.07.29   點擊181次

一、生物系統中的去汙劑

去汙劑是兩性分子,其長親脂性烴基(尾部)末端連有極性或帶電荷的親水基團(頭部)(圖1)。它們能夠降低水的表面張力,因此也被稱爲表面活性劑。

圖1 陰離子去汙劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的結構,其中顯示了親水和疏水區域

與純極性或非極性分子不同,兩性分子在水性介質中表現出獨特的性質。它們的極性基團與水分子形成氫鍵,而烴鏈由于疏水相互作用而聚集。在低濃度下,去汙劑在水中以單體形式存在,當濃度足夠高時,即達到臨界膠束濃度(CMC)時,單體自發形成非共價聚集物,成爲膠束。

在膠束中,每個去汙劑分子的極性親水區域朝向極性溶劑(水),而疏水區域形成熱力學穩定的疏水核。圖2爲膠束簡圖,其解釋了膠束的方向概念。真實的膠束結構更複雜、更動態,並且可能隨去汙劑濃度和溶液組成而變化。

圖2 SDS膠束簡圖

二、去汙劑如何溶解膜蛋白?

去汙劑被廣泛用于生物化學、細胞生物學和分子生物學研究。常見的應用包括細胞裂解、膜蛋白和脂質溶解、蛋白質結晶以及減少印迹實驗的背景染色。

盡管研究膜蛋白是蛋白質生物化學中的一大難題,但由于膜蛋白具有顯著的生物學和藥理學相關性,它們依然是一個重要的研究領域。了解膜蛋白的結構和功能需要小心分離出高純度的天然膜蛋白。由于形成膠束的去汙劑提供的兩性環境可模仿脂質雙分子層,因此,它們成爲膜蛋白功能和結構研究中必不可少的增溶劑。

生物膜由磷脂構成,磷脂含有兩個疏水基團以及與之相連的一個極性頭部。這種分子結構使磷脂能夠組裝成脂質雙分子層,其中疏水鏈面向彼此,而極性頭部朝向外側的水溶液環境(圖3)。蛋白質和脂質鑲嵌在這個雙層結構中,形成流動鑲嵌模型(圖4),該模型于1972年由Singer和Nicolson首次提出。脂質尾部與疏水蛋白質區域之間的疏水相互作用使蛋白質保留在脂質雙分子層中。這些內在膜蛋白(IMP)(圖4)不溶于水溶液,因爲它們聚集在一起可保護其疏水區域;但它們可溶于去汙劑,因爲去汙劑形成的膠束與生物膜雙分子層具有相似的結構。

疏水相互作用將蛋白質整合至這些膠束中。通常鑲嵌在膜脂質雙分子層中的膜蛋白疏水區域,現在被一層去汙劑分子包圍,而親水區域暴露于水性介質中,從而使膜蛋白溶于溶液。完全去除去汙劑會使膜蛋白疏水區域聚集,進而導致膜蛋白聚集和沉澱。

圖3 磷脂雙分子層

圖4 生物膜的流動鑲嵌模型

去汙劑的膜溶解過程可以分爲三個階段,其中去汙劑-脂質-蛋白質比率是一個重要因素(圖5)。

圖5.去汙劑溶解生物膜的三個階段。當向生物膜中加入低濃度去汙劑時(a),去汙劑單體(紅色線條,帶單尾)分散至脂質雙分子層中而擾亂膜結構(b)。當濃度等于或高于去汙劑的CMC時,脂質雙分子層中的去汙劑分子飽和並分裂,産生脂質-蛋白質-去汙劑混合膠束(c)。去汙劑/蛋白質比率約爲1-2(w/w)被認爲足以溶解IMP,以形成脂質-蛋白質-去汙劑混合膠束。去汙劑濃度進一步增加會導致脂質-蛋白質-去汙劑混合膠束逐漸脫脂,形成脂質/去汙劑和蛋白質/去汙劑混合膠束(d)。複合物中溶解的IMP與去汙劑結合,産生蛋白質-去汙劑複合物(PDC)。通常,去汙劑/蛋白質比率約爲10 (w/w)或更高時,將導致完全脫脂。

三、去汙劑的分類

1、離子去汙劑

離子去汙劑含有陰離子或陽離子頭部基團並具有淨電荷。它們的疏水尾部是直烴鏈(如十二烷基硫酸鈉(SDS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))或剛性甾體基團(如膽汁酸鹽)。離子去汙劑膠束的尺寸取決于側鏈的疏水引力與離子基團的排斥力的綜合作用。因此,通過增加反荷離子的濃度來中和頭部基團的電荷,將導致膠束尺寸變大。膠束尺寸也會隨烷基鏈長度的增加而增加。離子去汙劑對于膜蛋白的溶解非常有效,但幾乎都會導致一定程度的變性。

十二烷基硫酸鈉(SDS)

産品編號CAS編號産品名稱産品規格
3241178151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)dust-free pellets, ≥99.0% (GC)
3241179151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)BioReagent, suitable for electrophoresis,   for molecular biology, ≥98.5% (GC)
3241180151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)BioXtra, ≥99.0% (GC)
3241181151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)for ion pair chromatography, ≥99.0%
3241182151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)ACS reagent, ≥99.0%
3241183151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)ReagentPlus, ≥98.5% (GC)
3241184151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)92.5-100.5% based on total alkyl sulfate   content basis
3241185151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)BioUltra, for molecular biology, ≥99.0% (GC)
3241186151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)≥98.0% (GC)
3241187151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)tested according to NF, mixture of sodium   alkyl sulfates consisting mainly of sodium dodecyl sulfate
3241188151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)≥90%
3241189151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)≥99.0% (GC), dust-free pellets
3241190151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)Vetec TM reagent   grade, ≥98%
3241191151-21-3十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)anhydrous, free-flowing, Redi-Dri TM, ACS reagent, ≥99.0%

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)

産品編號CAS編號産品名稱産品規格
309627957-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium   Bromide)PharmaGrade, USP/NF,   Manufactured under appropriate controls for pharma or biopharmaceutical   production.
309628057-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)BioXtra, ≥99%
309628157-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)Vetec TM reagent grade, 96%
309628257-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)BioUltra, for molecular biology, ≥99.0% (AT)
309628357-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)for molecular biology, ≥99%
309628457-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)for ion pair chromatography
309628557-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)≥98%
309628657-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)analytical standard
309628757-09-0十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)≥96.0% (AT)

膽汁酸鹽是一種陰離子去汙劑,其主鏈由剛性甾體基團組成,如膽酸鈉鹽和脫氧膽酸鈉鹽。

産品編號CAS編號産品名稱産品規格
3241719345909-26-4牛膽酸鈉 水合物≥97.0% (TLC)
3248791345909-26-4牛磺膽酸 鈉鹽 水合物≥95% (TLC)
3248792345909-26-4牛磺膽酸 鈉鹽 水合物BioXtra, ≥95% (TLC)

這些分子的平面結構使其具有一個極性面和一個非極性面;因此,它們的CMC較高,膠束較小,使其易于通過透析去除。膽汁酸是相對溫和的去汙劑,其滅活作用通常低于具有相同頭部基團的直鏈去汙劑。遊離膽汁酸單體的pKa值約爲5-6,並且在低pH值下具有有限的溶解度。然而,膽汁酸的綴合會降低pKa,並且會在任何給定pH下産生更大比例的離子化分子。由于膽汁酸的離子化鹽形式比質子化酸形式更易溶于水,因此其綴合增強了在低pH環境中的溶解度。

2、非離子去汙劑

非離子去汙劑含有不帶電的親水頭部基團,其由聚氧乙烯部分(如BRIJR和TRITON™去汙劑)或糖苷基團(如辛基葡糖苷和十二烷基麥芽糖苷)組成。由于非離子去汙劑會破壞脂質-脂質和脂質-蛋白質相互作用,但不會破壞蛋白質-蛋白質相互作用,所以其被認爲是非變性去汙劑。正因如此,它們被廣泛用于分離生物活性形式的膜蛋白。與離子去汙劑不同,鹽對非離子去汙劑的膠束尺寸影響很小。

具有聚氧乙烯頭部基團的去汙劑可能含有化學通式爲CnH2n+1(OCH2CH2)xOH的烷基聚乙烯,或位于烷基鏈和醚基之間的苯環。TRITON™X-100去汙劑屬于後者。應注意,含芳環的去汙劑在紫外區域具有光吸收,這可能會幹擾在280nm處的蛋白質分光光度監測。這些去汙劑還有氫化形式可供選擇,其通過還原芳環而消除紫外吸收。

産品編號CAS編號産品名稱産品規格
32561739002-93-1Triton™ X-100BioUltra, for molecular biology, ~10% in H2O
32561669002-93-1Triton™ X-100for molecular biology
32561679002-93-1Triton™ X-100Vetec TM reagent grade
32561689002-93-1Triton™ X-100laboratory grade

但是,這種還原制劑中可能存在少量未反應的物質。或者,含有脂質疏水基團的市售聚氧乙烯去汙劑可以取代某些應用中的芳香族聚氧乙烯。例如,在紫外不可見性比較重要的應用中,TERGITOL™ 15-S-9TERGITOL™ TMN-10、聚氧乙烯月桂醇醚和聚乙二醇10十三烷基醚通常可替代TRITON™ X-100。這些去汙劑具有脂質疏水基團,因此在紫外區域無明顯光吸收。

盡管聚氧乙烯比合成非離子去汙劑(如烷基糖苷)具有明顯的成本優勢,但後者仍是許多應用的首選去汙劑,主要有兩個原因。第一,合成非離子去汙劑的成分和結構均勻。第二,含有不同烴鏈和極性糖基團組合的幾種烷基糖苷變體易于合成爲純淨物形式。烷基糖苷具有連接至葡萄糖、麥芽糖或蔗糖頭部基團的各種烷基鏈,使其在物理化學性質方面具有微小差異,這種差異可用于膜蛋白的選擇性增溶。

3、兩性離子去汙劑

兩性離子去汙劑兼具離子和非離子去汙劑的特點。與非離子去汙劑一樣,兩性離子去汙劑不具有淨電荷,缺乏導電性和電泳遷移率,並且不與離子交換樹脂結合。但是,與離子去汙劑一樣,它們能夠有效破壞蛋白質-蛋白質相互作用。甾體類兩性離子去汙劑,如CHAPS,比直鏈兩性離子去汙劑(如,十二烷基二甲基二胺氧化物)的變性能力弱。

四、去汙劑選擇指南

如果以100,000×g的速度將裂解物或勻漿物離心1小時後,膜蛋白存在于上清液中,則認爲膜蛋白已溶解。在大多數情況下,經過去汙劑溶解後,膜蛋白的生物活性應保留在上清液中。因此,合適的去汙劑應將最大數量的生物活性蛋白質保留在上清液中。目前市面上有大量的去汙劑,因此,選擇合適的去汙劑可能非常困難。以下幾點建議將有助于選擇合適的去汙劑:

1、查閱文獻並嘗試一種曾被用于分離和表征具有相似生化或酶學特性的蛋白質的去汙劑;

2、考慮去汙劑在工作溫度下的溶解度。例如,二甲基棕榈基氨丙磺酸鹽(SB3-16)在4℃不溶于水,而TRITON™ X-114去汙劑在室溫下會發生相分離;

3、考慮去汙劑的去除方法。如果使用透析法,則最好使用具有高CMC的去汙劑。另外,如果使用離子交換色譜法,則非離子或兩性離子去汙劑更合適;

4、爲保留生物或酶活性,可能需要對多種去汙劑進行試驗。去汙劑的類型和用量都會影響蛋白質活性。有些蛋白質的生物活性僅能在非常窄的去汙劑濃度範圍內保留。低于該濃度範圍,蛋白質不溶解;而高于特定濃度,蛋白質將失活;

5、考慮下遊應用。由于TRITON™ X-100去汙劑含有的芳香環可在260-280 nm吸光,因此,如果實驗方案要求對蛋白質濃度進行紫外監測,則應避免使用該去汙劑。同樣,如果通過等電聚焦分離蛋白質,則應避免使用離子去汙劑。在蛋白質凝膠電泳中,應考慮使用聚集數較小的去汙劑;

6、考慮去汙劑的純度。應使用純度極高的去汙劑,因爲TRITON™ X-100等去汙劑通常含有過氧化物汙染物;

7、對于應避免DNA酶、RNA酶和蛋白酶等汙染物的研究,有多種分子生物學級別的去汙劑可供選擇;

8、無毒去汙劑優于有毒去汙劑。例如,洋地黃苷是一種強心苷,應謹慎處理;

9、由于一些未知的原因,特定去汙劑通常更適用于一些特定分離程序。例如,正十二烷基-β-D-麥芽糖苷已被發現是分離細胞色素C氧化酶的首選去汙劑。因此,爲確定分離生物活性膜蛋白的最佳條件,可能需要一些試錯試驗;

10、有時很難找到一種既適合溶解也適合分析指定蛋白質的最佳去汙劑。在這種情況下,通常可以先用一種去汙劑溶解蛋白質,然後改用另一種對分析幹擾最小的去汙劑來分析蛋白質;

11、在某些情況下,已觀察到在分離緩沖液中添加含非去汙磺基酸甜菜堿(NDSB)的去汙劑,可顯著改善膜蛋白的溶解。

默克生命科學(西格瑪奧德裏奇)
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